Nous avons mis au point une spectroscopie confocale multicolore à molécule unique avec une sensibilité de détection optimisée sur trois canaux spectralement distincts pour l'étude des interactions biomoléculaires et du FRET entre plus de deux molécules. En utilisant des dispositifs acousto-optiques programmables comme séparateur de faisceaux et filtre d'excitation, nous surmontons certaines des limitations des séparateurs de faisceaux multichroïques conventionnels et mettons en œuvre une alternance rapide entre trois lignes laser. Cela permet de visualiser la synthèse des jonctions à trois voies de l'ADN sur la base d'une seule molécule et de résoudre sept sous-populations stœchiométriques ainsi que de quantifier le FRET en présence de voies de transfert d'énergie concurrentes. En outre, la capacité d'étudier les mouvements moléculaires corrélés en surveillant simultanément plusieurs distances au sein d'un complexe biomoléculaire est démontrée.