Unités de base et propriétés d'un microscope à fluorescence à illumination plane unique

La question critique de tous les microscopes à fluorescence est l'utilisation efficace des fluorophores, c'est-à-dire la détection du plus grand nombre possible de photons provenant des fluorophores excités, ainsi que l'excitation des seuls f luorophores qui se trouvent dans le plan focal. Cette question est abordée dans la mise en œuvre par l'EMBL d'un microscope à illumination plan unique SPIM , qui n'illumine que les f luorophores dans le plan focal de la lentille de l'objectif de détection. La nappe de lumière est un faisceau collimaté dans une direction et focalisé dans l'autre. Étant donné qu'aucun fluorophore n'est excité en dehors du plan focal des détecteurs, la méthode fournit également un sectionnement optique intrinsèque. Le nombre total de points temporels observables peut être amélioré de plusieurs ordres de grandeur par rapport à un microscope confocal à fluorescence. Le facteur d'amélioration réel dépend du nombre de plans acquis et nécessaires pour atteindre un certain rapport signal/bruit.

Un SPIM se compose de cinq unités de base, qui concernent 1 la détection de la lumière, 2 l'illumination de l'échantillon, 3 la génération d'un faisceau de lumière approprié, 4 la translation et la rotation de l'échantillon, et enfin 5 le contrôle des différentes parties mécaniques et électroniques, la collecte des données et le post-traitement des données. Nous décrivons tout d'abord les unités de base du SPIM de l'EMBL et ses propriétés les plus importantes. Nous couvrons ensuite les principes de base qui sous-tendent cet instrument et ses propriétés uniques telles que l'utilisation efficace des f luorophores, la réduction des effets photo toxiques, la véritable capacité de sectionnement optique et l'excellente résolution axiale. Nous discutons également de la manière dont une résolution isotrope peut être obtenue. La configuration optique, le matériel de contrôle et le schéma de contrôle sont expliqués en détail. Nous décrivons également certains perfectionnements moins évidents de l'installation de base qui permettent d'améliorer les performances. Les propriétés de l'instrument sont démontrées par des images d'échantillons biologiques qui ont été imagées avec l'un des SPIM de l'EMBL.

2007 Institut américain de physique.